Hibernasyonda rana macrocnemis (amphibia : anura)' da dna hasarinin araştirilmasi

Abstract

Deoksiribonükleik asit (DNA), yaşamsal hücresel işlevlerin sürdürülebilmesi için hayati öneme sahip olmakla birlikte, bir dizi endojen ve ekzojen faktör tarafından hasara uğratı-labilen hassas bir yapıdır. Metabolik yan ürünler olarak üretilen reaktif oksijen türleri (ROS), iyonize radyasyon, çevresel toksinler ve termal dalgalanmalar gibi genotoksik etkenler, iplikçik kırıkları, baz modifikasyonları ve diğer yapısal bozulmalar dahil olmak üzere bir dizi lezyona yol açabilir.

Bu çalışmada, DNA hasarını nicel olarak değerlendirmek için Single Cell Gel Electrop-horesis tekniği, yaygın olarak bilinen adıyla Comet Assay (Kuyruk Analizi) yöntemi kul-lanılmıştır. Yöntem, yüksek hassasiyeti, teknik uygulanabilirliği ve uygun maliyeti nede-niyle seçilmiştir. Çalışmada, anura türü Rana macrocnemis'e ait 15 bireyden periferik kan örnekleri alınmıştır. Sonrasında, örnekler mikroskop lamları üzerinde düşük erime noktalı agaroz içine gömülmüştür.

Hücre zarları ve nükleer bileşenler, DNA'yı serbest bırakmak için standart bir alkali lizis tamponu kullanılarak çözündürülmüştür. Lizisi takiben, lamlar yüksek pH koşullarında elektroforeze tabi tutulmuştur. Bu işlem, negatif yüklü fragmente DNA'nın nükleer çe-kirdekten anota doğru göç etmesine ve karakteristik bir "kuyruk" oluşturmasına neden olur. Elde edilen nükleoidler floresan bir DNA-bağlayıcı boya ile boyanmış ve floresan mikroskobu altında görüntülenmiştir. DNA hasarı, dört standart parametre kullanılarak ölçülmüştür: Comet Uzunluğu (CL), Kuyruk Uzunluğu (TL), Kuyruktaki DNA Yüzdesi (%Tail DNA) ve hem kuyruk uzunluğunu hem de DNA'nın içindeki dağılımı entegre eden Zeytin Kuyruk Momenti (OTM).

Fizyolojik ölçümlere tezat oluşturan şekilde, Comet Assay hibernasyonun belirgin bir stres etkisini ortaya koymuştur. Hibernasyon sonrası analiz, ölçülen tüm DNA hasarı parametrelerinde (CL, TL, %Tail DNA ve OTM) istatistiksel olarak oldukça anlamlı ar-tışlar (p < 0.001) göstermiştir. Assayın geçerliliği, maksimum düzeyde DNA hasarı sergi-leyen pozitif kontrol grubu ile doğrulanmış ve böylece protokolün genotoksisiteyi tespit etmedeki etkinliği teyit edilmiştir.

Çalışmada fizyolojik gözlemler ise, R. macrocnemis' te hibernasyon öncesi dönemle iliş-kili fizyolojik değişiklikleri de belgelemiştir. Bireylerde belirgin bir davranışsal hareket-sizlik, uzuvların vücuda yaklaştırılması ve bariz küresel bir vücut postürü gözlemlenmiş-tir. Hibernasyon öncesi ve sonrası morfometrik verilerin (vücut ağırlığı ve snout-vent uzunluğu) karşılaştırmalı analizi, bir azalma eğilimi göstermesine rağmen, bu farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p > 0.05).

Elde edilen bulgular, R. macrocnemis'te hibernasyonun makro fizyolojik parametrelerde yalnızca minimal ve anlamsız değişikliklere yol açtığını, ancak önemli moleküler strese neden olarak kayda değer DNA fragmantasyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. Bu genotoksik etkinin, muhtemelen metabolik baskılanma ve özellikle enerji açısından de-manding olan uyanma (arousal) fazları sırasında reaktif oksijen türleri (ROS) üretimin-deki eşzamanlı bir artışa atfedilebileceği düşünülmektedir.

Bu sonuçlar, hibernasyonun sadece uyum sağlayıcı bir enerji koruma durumu olmadığını, aynı zamanda önemli bir oksidatif ve genotoksik zorlanma dönemini temsil ettiğini vur-gulamaktadır. Çalışma, amfibilerde hibernasyon fizyolojisi ile moleküler stres biyo-belirteçleri arasındaki ilişkiyi aydınlatmakta ve Türkiye'nin yüksek rakımlı ekosistemle-rinde yaşayan R. macrocnemis'in kışlama stratejileri ve hücresel altı duyarlılığı hakkında kritik bilgiler elde edilmiştir.

Deoxyribonucleic acid (DNA) is inherently susceptible to damage from a multitude of endogenous and exogenous factors, which can compromise its integrity and, consequ-ently, vital cellular functions. Genotoxic insults, including reactive oxygen species (ROS) generated as metabolic byproducts, ionizing radiation, environmental toxins, and thermal fluctuations, can induce a spectrum of lesions such as strand breaks, base modi-fications, and other structural aberrations. To quantitatively evaluate DNA damage, this study employed the Single Cell Gel Elect-rophoresis technique, widely known as the Comet Assay. This method was selected for its high sensitivity, technical practicality, and cost-effectiveness. Peripheral blood samp-les were collected from a cohort of 15 individuals of the anuran species Rana macroc-nemis. Subsequently, the samples were embedded in a layer of low-melting-point agaro-se on microscope slides. Cell membranes and nuclear components were solubilized using a standard alkaline lysis buffer to liberate the DNA. Following lysis, the slides were subjected to electrophoresis under high pH conditions. This process causes negatively charged fragmented DNA to migrate away from the nuclear core (the "head") towards the anode, forming a characte-ristic "comet tail." The resulting nucleoids were stained with a fluorescent DNA-binding dye and visualized via fluorescence microscopy. DNA damage was quantified using four standard parameters: Comet Length (CL), Tail Length (TL), the percentage of DNA in the tail (%Tail DNA), and Olive Tail Moment (OTM), which integrates both the tail length and the distribution of DNA within it. In contrast to the physiological metrics, the Comet Assay revealed a profound genotoxic effect of hibernation. Post-hibernation analysis demonstrated statistically highly signifi-cant increases (P <0.001) in all measured DNA damage parameters: CL, TL, %Tail DNA, and OTM. The validity of the assay was confirmed by the positive control group, which exhibited the maximum level of DNA damage, thereby verifying the protocol's efficacy in detec-ting genotoxicity. The study also documented physiological changes associated with the pre-hibernation phase in R. macrocnemis. Individuals exhibited marked behavioral quiescence, adduc-tion of the limbs towards the body, and a pronounced spherical body posture. A compa-rative analysis of morphometric data (body mass and snout-vent length) before and after the hibernation period indicated a trend toward reduction; however, these differences were not statistically significant (P> 0.05). The findings indicate that while hibernation in R. macrocnemis results in only minimal and non-significant changes in gross physiological parameters, it imposes significant molecular stress, culminating in substantial DNA fragmentation. This stress impact is likely attributable to metabolic suppression and a concomitant surge in the production of reactive oxygen species (ROS), particularly during the energetically demanding arousal phases. These results underscore that hibernation is not solely an adaptive energy-conserving state but also represents a period of considerable oxidative and genotoxic challenge. The study elucidates the association between hibernation physiology and mo-lecular stress biomarkers in amphibians, providing critical insights into the overwintering strategies and subcellular vulnerability of R. macrocnemis inhabiting high-altitude ecosystems in Turkey.