KANOLA (Brassica Napus L.) FİDELERİNDE KROM(VI) TOLERANSI ve PROTEOM DEĞİŞİMLERİ ÜZERİNE KROM(VI) ve SÜLFATIN ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI

Abstract

Bu çalışmanın birinci aşamasında, 8 kanola (Brassica napus L.) çeşidinin (Champlain, Dante, Heros, Nelson, NK Petrol, Sary, Süzer ve Vectra) hekzavalent krom [Cr(VI)] için fitoremediasyon potansiyelleri hidroponik kültür ortamında değerlendirilmiştir. Bu amaçla, 7 gün süreyle Cr(VI) stresine (0, 10, 50 ve 100 µM potasyum dikromat) maruz bırakılan 14 günlük kanola fidelerinde büyüme, Cr birikimi, malondialdehit (MDA) içeriği, klorofil içeriği, protein olmayan tiyol (NPT) içeriği ve bazı antioksidan enzimlerin [süperoksit dismutaz (SOD), guaiakol peroksidaz (POD) ve katalaz (CAT)] aktivitesindeki değişimler incelenmiştir. Cr(VI) stresi kuru ağırlık (KA), klorofil içeriği ve CAT aktivitesinde azalmaya, MDA içeriği, NPT içeriği, SOD ve POD aktivitelerinde artışa neden olmuştur. Kuru ağırlık temelinde belirlenen tolerans indeksi NK Petrol çeşidinde maksimum (%82.5-74.1), Sary çeşidinde ise minimum (%65.7-40.8) olarak bulunmuştur. Sary çeşidi, düşük klorofil seviyeleri ve yüksek MDA içeriği ile ilişkili olarak en yüksek oranda (705.8 μg g1 KA) Cr biriktirmiştir. Bununla birlikte, en düşük Cr birikimi (255.0 μg g1 KA) NK Petrol çeşidinde bulunmuştur. Ayrıca, NK Petrol çeşidi Cr(VI) stresi altında yüksek klorofil içeriğini ve CAT aktivitesini sürdürmüştür. Sary çeşidinde göre NK Petrol çeşidi nispeten Cr’u dokuları dışında tutabilen bir çeşit olmasına rağmen, daha yüksek oranda biyokütle üreterek Cr(VI) stresini tolere edebildiği için Cr ile kirlenmiş alanların fitoremediasyonu için potansiyele sahip olabilir.

Bu çalışmanın ikinci aşamasında, Cr(VI) toleransında farklılık gösteren nispeten Cr-toleranslı (NK Petrol) ve Cr-hassas (Sary) kanola çeşitlerinde kükürt (S) beslemesi ve Cr(VI) stresi arasındaki etkileşimler değerlendirilmiştir. Kanola fideleri 7 gün süreyle S-yeterli (1 mM S) besin çözeltisinde büyütülmüştür. Sonrasında fideler farklı S konsantrasyonlarında [0 mM S (–S), 1 mM S (+S) ve 2 mM S (+HS)] 7 gün daha büyütülmüştür. On dört günlük fideler 3 gün süreyle 6 farklı uygulamaya maruz bırakılmıştır: (1) +S/−Cr; 1 mM sülfat, 0 μM Cr(VI) (kontrol), (2) +S/+Cr; 1 mM sülfat, 100 μM Cr(VI), (3) −S/−Cr; 0 mM sülfat, 0 μM Cr(VI) (kükürt eksikliği), (4) −S/+Cr; 0 mM sülfat, 100 μM Cr(VI) (kombine stres), (5) +HS/−Cr; 2 mM sülfat, 0 μM Cr(VI) (aşırı S uygulaması) ve (6) +HS/+Cr; 2 mM sülfat, 100 μM Cr(VI). Bu süre sonunda fideler büyüme, Cr birikimi, MDA içeriği, klorofil içeriği, tiyol içeriği, sistein içeriği, askorbik asit (AsA) ve glutatyon (GSH) içerikleri, bazı antioksidan enzimlerin [SOD, POD, CAT, askorbat peroksidaz (APX), glutatyon S-transferaz (GST) ve glutatyon redüktaz (GR)] aktivitesi, metallotiyonein protein 1 geninin (BnMP1) ifade seviyesi ve yaprak proteomundaki değişimleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Sary çeşidinin büyüme parametrelerinde, –S/–Cr ve –S/+Cr uygulamaları belirgin bir azalmaya neden olmuştur. Maksimum Cr birikimi –S/+Cr bitkilerinde ve özellikle de Sary çeşidinde belirlenmiştir. Sary çeşidindeki yüksek seviyedeki Cr, MDA içeriğini arttırmış ve klorofil içeriğini azaltmıştır. Antioksidan enzimlerin aktivitesi ve sistein içeriği –S/+Cr koşulları altındaki NK Petrol çeşidinde daha yüksek bulunmuştur. Antioksidan metabolitlerin (AsA ve GSH) içerikleri her iki çeşitte –S/–Cr uygulaması tarafından azaltılmıştır. BnMP1 geninin ifade seviyesi NK Petrol çeşidinde –S/+Cr uygulaması, Sary çeşidinde ise +S/+Cr ve +HS/+Cr uygulamaları tarafından arttırılmıştır. Bu sonuç, metallotiyonein proteininin S kullanılabilirliği sırasında değil, S-eksikliği altında Cr toleransında fonksiyon görebileceğini ileri sürmektedir. Sonuç olarak, kükürt beslemesinin Cr alınımını engellenmesinin yanı sıra savunma sistemleri ve gen ifadesi üzerindeki pozitif etkileri ile de toleransı arttırmıştır.

Mevcut araştırmada, nispeten Cr-toleranslı NK Petrol ve Cr-hassas Sary kanola çeşitlerinde kükürt beslemesi ve Cr(VI) stresi ile ilişkili proteom değişimleri belirlenmiştir. İki-yönlü jel elektroforezi ile analiz edilen yaprak protein profilleri, farklı S konsantrasyonları ve Cr(VI) stresine cevap olarak farklı şekilde ifade olan 65 proteini ortaya koymuştur. Farklı şekilde ifade olan bu proteinlerden 46 protein beneği MALDI-TOF/TOF kütle spektrometrisi ve veri tabanı taraması ile başarılı bir şekilde tanımlanmıştır. Farklı şekilde ifade olan proteinlerin büyük çoğunluğunun fotosentez, enerji metabolizması ve stres savunmada fonksiyon gördüğü belirlenmiştir. Stres savunma ile ilişkili olarak 2-Cys peroksiredoksin BAS1, glutatyon S-transferaz, ferritin-1, L-askorbat peroksidaz 1, tiazol biyosentetik enzim ve mirosinaz-bağlayıcı protein-benzeri proteinin nispeten Cr-hassas Sary çeşidine göre Cr-toleranslı NK Petrol çeşidinde kükürt eksikliği ve Cr(VI) stresine cevap olarak daha fazla artış göstermiştir. NK Petrol çeşidinde enerji metabolizmasında fonksiyon gören proteinlerin bolluğundaki daha fazla artışın muhtemelen yüksek enerji talebini karşılamak için Cr(VI) stresi altındaki hücrelere yardım edebileceği ileri sürülebilir. Diğer taraftan, NK Petrol çeşidinde moleküler şaperonun (20 kDa şaperonin) artan ifadesi, yanlış katlanmış proteinlerin tekrar katlanması ve protein fonksiyonlarının stabilizasyonu için ilave savunma mekanizması olabileceği ileri sürülebilir. Mevcut proteomik çalışmanın bulguları, kanola çeşitlerinde kükürt eksikliği ve Cr(VI) toleransının moleküler mekanizmaları ile ilgili birincil verileri sağlamıştır.