Amniyotik sıvı kaynaklı kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasının optimizasyonunda adaylar: TGF-β3, 17β-estradiol ve osteoprotegerin

Abstract

Kemik doku, organik ve inorganik maddelerden oluĢan kompleks bir dokudur. Hormonlar, büyüme faktörleri, sitokinler, iz elementler gibi birçok unsurun etki gösterdiği kemik dokuda 100‟ün üzerinde hastalık ve sendrom tanımlanmıĢtır. Her biri karmaĢık ve farklı yaklaĢımlar gerektiren bu hastalıklar, kemik rejenerasyonu ile ilgili giriĢimlere ihtiyaç duyan bireylerde yenilikçi hücresel tedavi yaklaĢımlarında problemlere sebep olabilecek potansiyeldedir. ÇalıĢmada osteoblast hücre hattı olan hfOB hücreleri üzerinde TGF-ß3 ve 17ß-estradiol kullanarak kemik metabolizmasında önemli role sahip olan osteoprotegerin (OPG) proteinin üretimi arttırılarak yüksek seviyede OPG içeren koĢullandırılmıĢ medyum (KM) elde edildi. Elde edilen yüksek seviyede OPG içeren KM‟nin yanı sıra TGF-ß3, 17ß-estradiol ve standart hfOB KM kullanılarak amniyotik sıvı kaynaklı kök hücrelerde (ASKKH) osteojenik farklılaĢtırma çalıĢmaları yapıldı. On dört ve yirmi bir günlük farklılaĢtırma çalıĢmalarının ardından hücreler real-time PCR yöntemi ile osteojenik belirteçler olan SPP1, RUNX2, COL1 ve DCN gen ifadeleri bakımından incelendi. Hücrelerde ayrıca Alizarin Red S boyamasının sayısal değerlendirmesi yapılarak kalsiyum birikimi seviyeleri belirlendi. Elde edilen veriler 17ß-estradiolün ASKKH‟leri hızla osteojenik farklılaĢmanın ileri safhalarına taĢıdığını ve mineralizasyonu arttırdığını gösterdi. Öte yandan TGF-ß3 ve OPG‟nin ise hücrelerin daha uzun süre erken osteoblastogenezis safhasında kalmasına yardımcı olduğu ve hücrelerde mineralizasyon miktarını düĢük seviyelerde tuttuğu görüldü. Daha hızlı kemikleĢme ve yüksek oranda mineralizasyonun amaçlandığı durumlarda 17ßestradiol daha baĢarılı sonuçlar vaat ederken hücrelerin erken osteoblastogenezis safhasında tutulmasının fayda sağlayacağı veya ekstansif mineralizasyonun sorun yaratacağı durumlarda ise TGF-ß3 ve OPG‟nin daha yararlı olabileceği düĢünülmektedir. ÇalıĢmadan elde edilen veriler diğer erken ve geç osteogenezis belirteçlerinden elde edilecek veriler ile zenginleĢtirilmeli; belirlenecek farklı zaman aralıkları ile hücrelerin osteogenezisin hangi aĢamasında ne kadar süre ile kaldığı belirlenmeli ve elde edilecek sonuçlar in vivo çalıĢmalar ile test edilmelidir.

Bone is a complex tissue which comprises of both organic and inorganic substances. There are numerous factors known to effect the tissue like hormones, growth factors, cytokins, trace elements, etc. and over 100 diseases and syndroms had been identified related with the the tissue. These pathological states which require comlex and unique treatments, have the potential to stimuate severe adverse effects in innovative cellular therapy approaches. In the study, production of osteoprotegerin (OPG), a very important protein for bone metabolism, is promoted in osteoblast cell line hfOB cells under the influence of TGF-ß3 and 17ß-estradiol and the condition mediums (CM) were collected as OPG rich CM. Amniotic fluid derived stem cells (AFSCs) were differentiated into osteogenic lineage using OPG rich CM, TGF-ß3, 17ß-estradiol and standart hfOB CM. The cells were analysed with real-time PCR after 14 and 21 day differentiations for gene expressions of osteogenic markers SPP1, RUNX2, COL1 and DCN. Furthermore, Alizarin Red S quantification were performed on differentiated cells to determine their calcium deposition levels. The data suggested that, 17ß-estradiol hastens the osteogenic differentiation progress and helps cells to reach late osteogenesis rather quickly while also augmenting the mineralisation of cells. In other respects, TGF-ß3 and OPG assists cells to stay in early osteoblastogenesis stage for a longer period and keeps mineralisation in low levels. In circumstances that enhanced bone formation and greater mineralisation is intended, 17ß-estradiol offers promising results while TGF-ß3 and OPG seems to be more prefferable in situations which extensive mineralisation is undesirable and use of early osteoblastogenic cells would be beneficiary. Data from the study should be further expanded with other early and late osteogenic markers and it also should be determined how long the cells remain in which stage of osteogenesis by setting different time intervals. Finally, the results of those studies should be tested with in vivo studies.