Prepubertal Dönemde Dişi Siçanlarda Melatonin/Kisspeptin Etkileşiminin Puberta Yaşina Ve Ovulasyonda Görevli Hormonlar Üzerine Etkisinin Belirlenmesi

Abstract

Bu araştırmanın amacı, prepubertal dönemde pinealektomili dişi sıçanlarda melatonin/kisspeptin etkileşiminin puberta yaşı ile ovulasyonda görevli hormonlar üzerine etkisini incelemektir. Araştırmada; pubertaya ulaşmamış, 25 günlük yaşta ve 60-80 gram canlı ağırlıkta, 126 adet dişi Wistar albino sıçan kullanıldı. Çalışma süresince hayvanlar 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık ortamda, oda sıcaklığında (20-24°C) tutularak, ticari pelet sıçan yemi ve normal çeşme suyu ile ad libitum beslendi. Sıçanların 108'ine pinealektomi, 18'ine ise sham pinealektomi operasyonu gerçekleştirildi. Sıçanlar 29 günlük yaşa ulaştığında ağırlıkları kayıt altına alınarak her bir grupta 18 sıçan olacak şekilde 7 gruba ayrıldı. Gruplar; kontrol (Sham), pinealektomi (PE), melatonin (PE+M), kisspeptin (PE+Kiss), kisspeptin antagonisti (PE+KissA), melatonin + kisspeptin (PE+M+Kiss) ve melatonin + kisspeptin antagonisti (PE+M+KissA) olacak şekilde oluşturuldu. Sham ve PE gruplarına 0,1 ml/24 h intraperitonal serum fizyolojik; PE+M grubuna günlük 0,5 mg/kg subkutan melatonin; PE+Kiss grubuna günlük 1 µg/kg intraperitonal kisspeptin, PE+KissA grubuna günlük 1 µg/kg intraperitonal kisspeptin antagonisti uygulandı. Tüm gruplarda enjeksiyonlar 21:00-23:00 saatleri arasında yapıldı. Hormon uygulamaları her gruptan 6 sıçan olacak şekilde (PE ve Sham hariç) 30 sıçana prepubertal 33. güne kadar; 30 sıçana siklus başlangıcından sonraki ilk foliküler döneme kadar; 30 sıçana ise siklus başlangıcından sonraki ilk luteal döneme kadar sürdürüldü. Sıçanlara 12 saatte bir vajinal açıklık kontrolü yapılırken, 33 günlük yaşta vajinal açıklık oluşmamış sıçanların her gruptan 6 adeti alınarak son hormon uygulamasını takiben 20. dakikada genel anestezi altında kalplerinden kan alınarak ötenazileri sağlandı. Vajinal açıklık kontrolü ile vajinal açıklığın oluştuğu gün kayıt altına alınırken, 12 saatte bir olacak şekilde vajinal yıkama yöntemiyle östrus takibi yapıldı. Vajinal yıkamanın kontrolünün yapılması için alınan kanlarda progesteron düzeyi belirlendi. Foliküler ve luteal dönemde bulunan tüm grupların her birinden altı sıçana son enjeksiyon uygulamalarının 20. dakikasını takiben kalplerinden kan alınarak ötenazi gerçekleştirildi. Araştırmada prepubertal 33. günde, melatonin uygulamasının pinealektomi (PE) grubuna kıyasla vajinal açıklık ile siklus görülme yaşını geciktirdiği, serum GnRH ve FSH düzeylerini azalttığı görülmüştür. Kisspeptin uygulaması ise tersine, Sham ve PE gruplarına göre vajinal açıklık yaşı ile siklus başlangıç yaşını kısaltırken, serum GnRH ve LH düzeylerini artırmıştır. Aynı zamanda prepubertal dönemde (33. gün); kisspeptinin, melatonin tarafından geciktirilmiş vajinal açıklık ile siklus başlangıç yaşını kısalttığı, aynı şekilde azalmış GnRH ve LH düzeylerini yükselttiği tespit edilmiştir. Ayrıca araştırmada; kisspeptin antagonisti, PE grubuna göre siklus başlangıç yaşını düşürürken, prepubertal 33. gün GnRH ve FSH düzeylerini de PE ve Sham grubuna göre azaltmıştır. Foliküler dönemde ise; kisspeptin uygulanan PE+Kiss ve PE+M+Kiss gruplarında diğer gruplara göre serum GnRH ve LH düzeyleri daha yüksek belirlenmiştir. Sonuç olarak; melatoninin GnRH ve FSH’ı baskılayarak pubertaya erişme süresi üzerindeki olumsuz etkisini kisspeptinin önlediği belirlenmiştir. Kisspeptinin aynı zamanda foliküler dönemde LH salınımını uyararak ovulasyonda görev aldığı görülmekle beraber; gerek pinealektomi operasyonunun yapıldığı yaş gerekse melatonin ve kisspeptinin uygulama doz, süre ve şekline bağlı olarak sonuçların değişebileceği düşünülmektedir.

The aim of this study is to examine the effect of melatonin/kisspeptin interaction on puberty age and hormones responsible for ovulation in pinealectomized female rats in prepubertal period.

In the study, 126 female Wistar albino rats at the age of 25 days with 60-80 grams of live weight were used. During the study, animals were kept at 12 hours light and 12 hour dark at room temperature (20-24°C), and fed ad libitum with commercial pelleted rat chow and regular tap water. Pinealectomy operation was performed to 108 of the rats and sham pinealectomy operation was performed to 18 of the rats. The weights of the rats were taken under record when they reached to 29 days of age and divided into 7 groups so that each group consists of 18 rats. Groups were created as; control (Sham), pinealectomy (PE), melatonin (PE+M), kisspeptin (PE+Kiss), kisspeptin antagonist (PE+KissA), melatonin + kisspeptin (PE+M+Kiss) and melatonin + kisspeptin antagonist (PE+M+KissA). 0.1 ml/24 h intraperitoneal serum physiologic to Sham and PE groups, daily 0.5 mg/kg subcutaneous melatonin to PE+M group, daily 1 mg/kg intraperitoneally kisspeptin to PE+Kiss group, daily 1 mg/kg intraperitoneal kisspeptin antagonist to PE+KissA group were administered. In all groups, injections were applied between 21:00 and 23:00 hours. Hormone administrations to 6 rats from each group (except PE and Sham) were continued until prepubertal 33th day to 30 rats, the first follicular period following the start of cyclus to 30 rats, and the first luteal period following the start of cyclus to 30 rats. Rats were checked for vaginal opening every 12 hours, and 6 rats with no vaginal opening at the 33 days of age from each group were taken and euthanized at the 20th minute following the final hormone administration under general anesthesia by taking blood from their hearts. The day of vaginal opening formation was taken under record with vaginal opening control, and oestrus monitoring was carried out every 12 hours by using vaginal douche method. Six rats from every group at follicular and luteal phase euthanized at the 20th minute following the final hormone administration under general anesthesia by taking blood from their hearts. For the control of vaginal douche, progesterone levels in the blood samples taken were determined.

In the research, it was found that, on the 33th day, melatonin administration, compared to pinealectomy (PE) group, delayed the vaginal opening and cyclus formation, whilst decreased the serum GnRH and FSH levels. Kisspeptin administration, on the contrary, compared to Sham and PE groups, expedited the vaginal opening and cyclus starting age, while increased the serum GnRH and LH levels. At the same time in prebubertal period (33th day), it was found that kisspeptin shortened the vaginal opening and cyclus starting age delayed by melatonin, and likewise, increased the reduced levels of GnRH and LH. Also in the study, kisspeptin antagonist, compared to PE group, shortened the cyclus starting age, while decreased the prepubertal 33th day GnRH and FSH levels, compared to PE and Sham groups. In the follicular phase, in kisspeptin administered PE+Kiss and PE+M+Kiss groups, serum GnRH and LH levels were found higher than the other groups.

As a result, it was found that kisspeptin avoided the negative impact of melatonin on the duration to reach puberty by suppressing GnRH and FSH. Also, it was seen that kisspeptin takes a role in ovulation by stimulating LH secretion in follicular period, and it is contemplated that the results may change depending on both the age the pinealectomy operations were performed and the dose, duration and method of melatonin and kisspeptin administration.