Nonilfenol ve Bisfenol A’nın Ames/Salmonella/Mikrozom Test Yöntemi Kullanılarak Mutajenik Etkisinin Belirlenmesi

Abstract

Çevresel mutajenlerin, özellikle gelismis toplumlarda pek çok olumsuz etkiler meydana getirdiği pek çok bilimsel makalede rapor edilmektedir (Ref). Canlı organizmların bu etkilere yasam süreleri boyunca maruz kaldıkları ve böylelikle genetik bozulmayı ve pek çok kanseri türünün ortaya çıkmasını tetiklediğine inanılmaktadır. Mutajenlerin kötü etkilerinden korunmak için önerilen çözüm yolları ise çevresel mutajenlerin tanımlanması ve canlı organizmaların bu ajanlara maruz kalmalarının en aza indirgenmesidir. Bu amacı gerçeklestirmek için ise hızlı ve doğru in vitro testlerin yapılması gerekmektedir. Mutajenlerin tanınlanması ve etkilerinin belirlenmesi için en yaygın kullanılan yöntem de Ames test yöntemidir (McCann and Ames, 1976) Bu yöntemde Salmonella typhimurium’un çesitli susları kullanılır. Bu standart test susları histidin oksotrofudur. Ancak her test susu belirli bir frekansla geriye dönerek histidinsiz ortamda üreyebilen koloniler verir. Bu kolonilere “spontan revertant” adı verilir. Bir kimyasalın bu test sisteminde mutajen olarak kabul edilmesi için TA98 ve TA100 ile verdigi revertant koloni sayısının, o susa özgü spontan revertant sayının en az iki katı olması gerekmektedir (Linstromber, W.W., 1983).Çesitli maddeler üzerinde Ames testi ile yapılan çalısmalar vardır. Örneğin; NF ve OF’nin toksisite ve östrojenik etkisine ait çok sayıda veri bulunmasına rağmen, bu kimyasalların mutajenik etkisi ile ilgili literatür az sayıdadır. Mutajenik etkinin belirlenmesi amacı ile NF 0.937- 4.685 μg/L aralığın da 6 farklı konsantrasyonda, OF ise 10- 160 μg/L aralığında 5 farklı konsantrasyonda test sistemi olarak seçilen Salmonella thyphimirium TA98 ve TA 100 susları üzerinde (metabolik aktivasyonsuz) test edilmistir. Sonuçlar revertant koloni sayılarına göre değerlendirildiğinde, tüm NF konsantrasyonlarının toksik olduğu buna rağmen mutajenik etkisinin olmadığı gözlenmistir (Boyacıoğlu. M., 2007) Bizim çalısmamızda NF’nin S9’lu yani metabolik aktivasyonlu deneyi de yapılmıstır. BF, NF ve OF ile yapılan diğer bir çalısmada bu maddelerin, üreme sistemi dısındaki bir organ olan karaciğer üzerindeki etkisi ve bu maddelerle birlikte uygulanan C vitamininin olası antioksidan etkisi arastırılmıstır. Çalısmada 42 adet erkek Wistar albino sıçandan 7 grup olusturulmustur (n=8). Uygulamalar oral yolla gün asırı (haftada üç defa) olmak üzere 45 gün boyunca yapılmıstır. Kontrol (K) grubuna sadece zeytinyağı, BF, NF ve OF gruplarına, 25 mg/kg/gün dozunda zeytinyağı içinde çözülmüs sırasıyla BF, NF ve OF uygulaması yapılmıstır. BF+C, NF+C, OF+C gruplarına aynı dozda sırasıyla BF, NF ve OF uygulamasından hemen önce 60 mg/kg/gün dozunda C vitamini uygulaması yapılmıstır. BF, NF ve OF gruplarına ait sıçanların serum AST, ALT ve LDH miktarlarında ve doku MDA konsantrasyonlarında kontrol grubuna göre P< 0,05 seviyesinde artıs saptanırken, BF+C, NF+C, OF+C gruplarında bu parametrelere ait değerler sırasıyla BF, NF ve OF gruplarından daha yuksek bulunmustur. Uygulama gruplarının doku GSH konsantrasyonları kontrol grubuna oranla P< 0,05 seviyesinde anlamlı ölçüde azalmıstır. BF+C, NF+C, OF+C gruplarında bu değerler sırasıyla BF, NF ve OF gruplarından daha düsüktür. BF, NF ve OF gruplarına ait karaciğer preparatlarında konjesyon ve mononüklear hücre infiltrasyonları gözlenirken BF+C, NF+C, OF+C gruplarında histopatolojik bulguların daha siddetli ve yaygın olduğu belirlenmistir. Sonuç olarak BF, NF ve OF sıçan karaciğerinde oksidatif strese bağlı olarak hasar yaratmıs, antioksidan olarak etki göstermesi beklenen vitamin C ise prooksidan etki göstererek endokrin bozucu bu kimyasalların yarattığı karaciğer hasarını artırmıstır (KORKMAZ. A., ve ark., 2009).Çesitli yiyecek ve içecek kaplarında, plastikler ve epoksi reçinelerde kullanılan BFA, yetiskin kadınların yumurtalık foliküler sıvısından rastgele alınan idrar örneklerinin % 95'inde tespit edilmistir. Bazı çalısmalar göstermistir ki, antral foliküller üzerindeki BFA’nın etkisi, eseysel steroid hormonlarının temel üreticileri olan foliküller ovulasyon yapabilir. Bu nedenle, bu çalısmanın hipotezine göre doğum sonrası testlere göre, BFA’ya maruz kalanlarda antral folikül gelisimi ve steroidogenezi engeller. Sonuç olarak; BFA’nın (440mm) folikül büyümesine engel olduğu ve bu pregnenolone cotreatment büyümenin devamının olmadığı gözlenmistir. Ayrıca, BFA 44 ve 440mm, dehidroepiandrosteron progesteron, estron, testosteron ve androstenedion ve estradiol üretimini de engeller (Peretz. J.,ark. 2011). Diğer bir çalısmada, sise sularında endokrin bozucu bilesiklerin(EDCs) olusumunu arastırmıstır. Đncelenen bilesikler BFA, NF, octylphenol dimetil fitalat (DMP), dietil phthalate (DEP), di-n-butil fitalat (DKB), bütil benzil ftalat (BBP) , di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) ve di (n-oktil) (DNOP) phthalate gibi kimyasallardır. Kötü depolama kosullarında sise sularındaki EDC’lerin varlığı 15 ve 30 gün arası dıs ortamda kaldıktan sonra incelenmistir. EDC’ler sıvı-sıvı ekstraksiyonu sonrası ve Gaz Kromatografi-Kütle Spektrometresi kullanımıyla belirlenmistir. Bu bilesiklerin çoğu yerel piyasadan satın alınan farklı markaların sise sularında tespit edildi. Açık hava kosullarındaki depolanma sartlarında incelendiğinde bilesiklerin konsantrasyonları üzerinde önemli bir etkisi yoktur. Sadece BFA polikarbonat kaplarda yüksek konsantrasyonlarda artıs gözlendi. Đçme suyunun EDC’ li tüketiminin tahmini miktarı çok düsüktür (Amiridou. D., 2011). 10 yılı askın bir zamandan beri, BFA’nın riskli miktarları uluslararası düzeyde tartısılmaktadır. 2008 yılında ABD Ulusal Toksikoloji Programı (NTP)’nda toksisite gelisimi üzerinde BFA’ya maruz kalma seviyesi üzerindeki etkileri açıklandı. Bu bağlamda, Fransız Gıda Güvenliği Ajansı (AFSSA) 5 mg/kg/gün (çesitli düzenleyici kurumlar tarafından belirlenen hiçbir etki düzeyi) altındaki dozların toksisitesi açısından gözden geçirilmesi kararı alınmıstır. Bu yazıda AFSSA tarafından yürtülen değerlendirmeler özetlenmektedir. Bu çalısmalar 3 grup olarak sınıflandırıldı: (i) toksisite bulunmadı, (ii) kaygıyla ilisiği olmayan sonuçlar (iii) uyarı sinyalleri veren rapor sonuçları. Uyarı sinyalinin anlamı, resmi olmayan sonuçlar değerlere dayalı sağlık olusumunun kurulumuyla iliskisi çizilebilir. Fakat düsük dozlardaki BFA ile toksisite ile ilgili bazı sorular akla gelmektedir. Bu çalısmalarda, uyarı sinyallerinin insan sağlığı için önemini anlamak için BFA düsük dozlarda ve daha genel olarak endokrin bozucular ile ilgili risklerin değerlendirilmesi için yeni yöntemler gelistirilmesinin gerekli olduğu sonucuna varıldı (Arnich. N., ve ark., 2010). NF ile yapılan çalısmamızın S9’lu deneyi sonucunda, Salmonella typhimurium TA 98 ve TA100 susları ile yapılan çalısmada uygulanan tüm dozların S9 varlığında elde edilen ortalama revertant koloni sayılarının S9 yokluğundaki revertant koloni sayılarına göre daha yüksek olduğu gözlemlenmistir. Buna dayanarak test ettiğimiz NF ve BFA’nın da canlı vücuduna girdiğinde metabolik reaksiyonlar sonucu olusan metabolitlerinin DNA ile etkilesimini bir miktar artırdığı düsünülebilir. Çalısmamızın amacı, NF ve BFA’nın Ames/Salmonella/Mikrozom Testi kullanılarak mutajenik potansiyellerini arastırmaktır. Mevcut çalısmamızda öncelikle toksik olmayan dozlar belirlendi ve hem S9’suz hem S9’lu deneyler ayrı ayrı 3’er plak halinde yapıldı. Her iki madde içinde denenen dozlar, 10000 Sg/plak; 1000 Sg/plak; 100 Sg/plak, 10 Sg/plak; 1 Sg/plak; 0,1 Sg/plak olarak belirlendi. Bu dozlar arasında 10000 Sg/plak ve 1000 Sg/plak dozları toksik olarak bulundu. Daha sonra toksik olmayan dozlarla Salmonella typhimurium’un TA98 ve TA100 suslarıyla S9’lu ve S9’suz deneyleri her iki madde içinde çalısıldı.Yapılan çalısmaların sonucunda BFA’nın ve NF’nin mutajenik olmadığı belirlenmistir. Yani BFA ve NF ile ön inkübasyona bırakılan Salmonella typhimurium TA98 ve TA100 susları ile gerçeklestirilen çalısmada metabolik aktivasyonlu (S9’lu) ve metabolik aktivasyonsuz (S9’suz) test edilen bütün dozlarda revertantların sayısında artıs olmadığı bulunmustur.