Amniotik Membran Kaynaklı Kök Hücreleri Üzerine Trombositten Zengin Plazmanın Etkisi

Abstract

Kök hücreler gelişen teknoloji ile birlikte biyomedikal alanında oldukça önemli bir tedavi aracı haline gelmiştir. Amniotik membran, kök hücre kaynakları arasında daha az immunojenite ve multipotentten daha yüksek potansiyelleri ile önemli bir kaynaktır. Bu çalışmada atların amniotik membranından elde edilen kök hücreler izole edilerek, kültüre edildi ve onuncu pasaja kadar çoğaltıldı. Bununla beraber hücreler üzerinde adipojenik, osteojenik, kondrojenik farklılaşmalar ve nörosfer oluşumu çalışmaları yapıldı. İki katına çıkma süresi analizi ile üçüncü pasaj ile altıncı pasaj arasında hücre çoğalmalarının daha güçlü olduğu ve dördüncü pasajda hem epitel (AEH) hem de mezenkimal hücrelerde (AMH) çoğalmanın en yüksek olduğu belirlendi. Büyüme eğrisi analizinde AEH ve AMH'lerde beşinci pasajın en iyi büyüme kinetiği özelliğini sergilediği görüldü. At kanından yüksek konsantrasyonda (717.17±43.34×109/L) tombosit içeren PRP hazırlanışı için çift santrüfüjlü bir teknik geliştirildi. Çalışmada, taze ve inaktif (PRP-1), taze ve CaCl2 ile aktive edilen (PRP-2), CaCl2 ile aktive edildikten sonra dondurulan (PRP-3) ve dondurma çözdürme işlemi ile aktive edilen (PRP-4) dört grup PRP kullanıldı. Çalışmada PRP grupları arasında belirgin bir fark olmaksızın yüksek konsant- rasyonda Epidermal büyüme faktörü (EGF) gözlendi. PRP-4 grubunda en yüksek konsantrasyonda Trombosit kökenli büyüme faktörü (PDGF) saptandı. MTT analizi ile hem AEH hem de AMH’de dondurma çözdürme ile aktive edilen PRP’nin (PRP-4) daha iyi çoğalma sağladığı ortaya kondu. Canlı hücre sayımı da dondurma çözdürme ile aktive edilen PRP’nin (PRP-4) daha iyi hücre proliferasyonunu sağladığını gösterdi. Farklı dozlardaki PRP kullanımlarında, dondurma çözdürme ile aktive edilen %5 PRP konsantrasyonunun hem AEC hem de AMC’lerde bütün analizlerde hücre çoğalmasını arttırdığı belirlenirken, %10 ve %15 PRP konsantrasyonları ile de yakın sonuçlar elde edildi. Farklılaşma çalışmalarında iki tip hücre de başarı ile osteojenik, adipojenik ve kondrojenik hücrelere farklılaştırıldı; bu farklılaşmalar alizarin red boyaması, Oil Red O boyaması ve alsian mavisi boyaması ile gösterildi. Nörosfer oluşumunda iki tip hücrenin de küre benzeri, üç boyutlu sinir doku progenitör hücreleri oluşturabilme yeteneğinde olduğu gözlendi. PCR analizinde pluripotent hücre belirteçleri olan SOX2 ve OCT3/4’te oldukça güçlü ekspresyon gözlendi. Hem AMH hem de AEH’lerde P0, P3, P5 ve P7’de multipotent kök hücre belirteçleri CD14, CD44, CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonları iyi seviyede gözlendi. Hemotopoetik hücre belirteci CD45 iki tip hücre için de negatif bulundu. Ayrıca MHC-II belirteci (CD74) de her iki hücre tipinde negatifdi. Bu sonuçlar, hem pluriopotent hem de multipotent kök hücre karakterizasyonu gösteren amnion membranından elde edilen kök hücrelerinin, allojenik uygulamalar için kullanılabilecek önemli bir kök hücre kaynağı olduklarını göstermektedir.