Sıradışı Çok Karpelli Çiçek Yapısına Sahip Endemik Legüm Türü Thermopsis Turcica’da Bazı Çiçek Organ Genlerinin Kısmi Klonlanması ve Sekanslanması

Abstract

Yabani legüm Thermopsis turcica’da sıra dışı çiçek morfolojisi, yani tek çiçekten 3-4 serbest karpel üretimini kontrol eden moleküler mekanizmaların belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu ana hedefe ulaşabilmek amacı ile bu çalışmada sepal, petal, stamen, karpel ve meyve gibi çiçek organlarının oluşumu ve gelişimini kontrol eden A-[APETALA1 (AP1), APETALA2 (AP2)], B-[ APETALA3 (AP3), PISTILLATA (PI)], C-[AGAMOUS (AG)], D-[SEEDSTICK (STK), SHATTERPROOF (SHP)] ve E-[SEPALLATA (SEP)] fonksiyonlu genlerin T. turcica'da kısmi klonlanması ve karakterizasyonu amaçlanmıştır.

T. turcica çiçek tomurcuklarından izole edilen total RNA özütü ilk iplik cDNA üretiminde kullanılmıştır. Özellikle legümler için bilinen hedef genlere ait nükleotid ve protein dizilerinden dejenere primerler tasarlanmıştır. PCR reaksiyonları cDNA kalıbı, gene özgü dejenere primer çifti ve PhusionTM polimeraz ile kurulmuştur. PCR ürünleri agaroz jelde yürütüldükten sonra, hedef DNA parçaları agaroz jelden kesilmiş, çıkarılmış ve saflaştırılmıştır. Hedef DNA parçaları pJET1.2 klonlama vektörüne yüklendikten sonra ligasyon ürünleri yetenekli DH5α E. coli hattına transforme edilmiştir. Koloni PCR tekniği transformantların doğru PCR ürünü içerip içermediğini belirlemede kullanılmıştır. Rastgele seçilmiş transformantlardan PCR ürününü bulunduran rekombinanat plazmid DNA'lar izole edilmiş ve dizilim analizi yapılmıştır. Nükleotid ve çıkarılmış protein dizi sonuçları hedefimizdeki tüm çiçek organ meristem kimlik genlerinin T. turcica'dan kısmi olarak başarılı bir şekilde elde edildiğini göstermiştir. AP1 için 667 nükleotid (nt), AP2 için 447 nt, AP3 için 480 nt, PI için 249 nt, AG için 402 nt, SHP için 296 nt, STK için 350 nt ve SEP için 441 nt dizileri en az üç bağımsız dizilemeyle belirlenmiştir. Bu dizilemelere ilaveten, qPCR gibi daha sonraki fonksiyonel analizlerde içsel kontrol genleri olarak kullanmak üzere 18S rRNA için 451nt ve β-ACTIN için 276 nt de dizilenmiştir. BLASTn, BLASTp ve CLUSTALw analizleri, T. turcica çiçek meristem kimlik genlerinin nükleotid ve çıkarılmış protein dizilerinin diğer legüm türlerinde belirlenmiş homologlarına çok benzediğini (%70-100 oranlarında) göstermiştir.

Sonuç olarak, T. turcica'da sekiz farklı çiçek organ meristemi kimlik geni mevcut araştırmada kısmen klonlanmış ve dizisel olarak karakterize edilmiştir. Bu dizi bilgileri hedef genlerin tam uzunluk cDNA dizileri ve fonksiyonel analizlerinin belirlenmesinde kullanılabilecektir.