TGFβ-3/IGF-1 ilave edilmiş kondrosit kaynaklı koşullandırılmış medyumun amniyotık sıvı kaynaklı hücrelerde kondrogenezis üzerine etkileri

Abstract

Kıkırdak parakrin faaliyeti ile bilinen bir dokudur ve kondrositlerin salgıladığı, başta TGF-β3 ve IGF-1 olmak üzere birçok humoral faktörün kondrojenik farklılaşmada rol aldığı düşünülmektedir. Kondrogenezis SOX9, COL2A1, TGF-β3 ve ACAN gibi bazı belirteçlerin ifadesi ile karakteize edilebilmektedir. Her ne kadar kök hücrelerin kondrojenik farklılaştırması için birçok protokol var olsa da, bu yöntemler doğal intrinsik mekanizmayı yeteri kadar taklit edememekte ve başarılı bir kıkırdak rejenerasyonunu sağlayamamaktadır. Kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasında doğal mekanizmayı daha iyi taklit edebilmek için koşullandırılmış medyumun hem tek başına hem de TGF-β3 ve/veya IGF-1 ile birlikte kullanımın kondrogenezise etkisini görmeyi ayrıca, koşullandırılmış medyuma standart kondrojenik indüksiyon medyumu ilavesinin kondrogenezis potansiyeli üzerine etkisini göstermeyi amaçladık. Bu amaç doğrultusunda çalışmada rat amniyotik sıvı kaynaklı kök hücreler ve rat kondrositleri izole edildi. İzole edilen hücrelerin Real-Time PCR ve immunfloresan yöntemleri ile karakterizasyonları yapıldı. Karakterizasyon çalışmalarından sonra kondrositlerden, koşullandırılmış medyum elde edildi ve rat amniyotik sıvı kaynaklı kök hücreler aljinat boncuklar içerisinde TGF-β3, IGF-1, koşullandırılmış medyum ve indüksiyon medyumu kullanılarak kıkırdak hücrelerine farklılaştırıldı. Farklılaştırma çalışmalarının sonuçları Real-Time PCR, immunfloresan ve immunohistokimyasal boyama yöntemleri ile desteklendi. Çalışmada koşullandırılmış medyumun, hem tek başına hem de IGF-1 ve/veya TGF-β3 ilavesi ile kondrojenik farklılaşmayı başarılı bir şekilde indüklediği görüldü. Ancak, koşullandırılmış medyum ve kondrojenik indüksiyon medyumunun birlikte kullanımının COL-II, ACAN ve SOX9 ifadesi bakımından en iyi sonuçları verdiği görüldü. Sonuç olarak kondrojenik farklılaşma için standart indüksiyon medyumunda bulunan maddelerin, koşullandırılmış medyumda bulunan humoral faktörlerin etkisi ile daha iyi bir farklılaşma elde edildiği düşünülmektedir. Ancak koşullandırılmış medyum içerisindeki maddelerin ve miktarlarının belirlenmesi koşullandırılmış medyumun kondrojenik farklılaşma üzerine etki mekanizmasının daha iyi anlaşılabilmesi için önemlidir. Bunun yanı sıra çalışmadan elde edilen sonuçlar yapılacak in vivo çalışmalarla test edilmelidir.

Cartilage is known for its paracrine activity and humoral factors released by chondrocytes especially TGF-β3 and IGF-1 are considered to play vital role in chondrogenic differentiation. The chondrogenesis can be characterized by expression of certain markers like SOX9, COL2A1, TGF-β1 and ACAN. Although, various protocols for chondrogenic differentiation of stem cells exist, yet these methods are unable to mimic intrinsic mechanisms of cartilage regeneration successfully. To better imitate the natural mechanism of chondrogenesis, conditioned media was opted for chondrogenic differentiation either with supplementation of TGF-β3 and/or IGF-1 or alone. It was also aimed to demonstrate whether external supplementation of conditioned media with standard chondrogenic induction media affects its chondrogenesis potential or not. Fot this purpose, rat amniotic fluid derived stem cells and chondrocytes were isolated and were characterized by Real-Time PCR and immunofluorescence studies. Following the characterization of chondrocytes, conditioned media was collected and rat amniotic fluid derived stem cells were differentiated into chondrocytes in alginate beads using conditioned media with TGF-β3 and/or IGF-1 supplementation or alone or with standard chondrogenic induction media. The results of differentiation studies were supported with Real-Time PCR, immunofluorescence and immunohistochemistry assays. The results showed that conditioned media have potential to induce chondrogenic differentiation successfully both alone and with the supplementation of TGF-β3 and/or IGF-1. Nonetheless, joint use of conditioned media and standard chondrogenic induction media provided the best results for COL2A1, ACAN and SOX9 expressions. In conclusion, it is believed that the constituents of induction media facilitate better chondrogenic differentiation when combine with the humoral factors from conditioned media. Yet, it is important to validate the components of conditioned media and their exact amounts for better understanding mechanisms of conditioned media based chondrogenic differentiation. Besides, the results of the conducted study should be tested with further in vivo experiments.