KOLON KANSERİ TANILI OLGULARDA MS-MLPA METODU İLE MMR(MISMATCH REPAIR=HATALI EŞLEŞME TAMİRİ) GENLERİNDE METİLASYON SIKLIĞININ SAPTANMASI

Abstract

Canlı organizmaların genomdaki fonksiyon kayıplarına genlerdeki çeşitli sayısal ve yapısal aberrasyonlar sebep olduğu gibi, genomda herhangi bir anormal değişiklik olmadan çevresel veya genetik şartlara bağlı olarak oluşabilen DNA metilasyonu gibi epigenetik faktörler de sebep olabilmektedir. Hatalı-eşleşme tamir mekanizması, çeşitli sebeplerle DNA üzerindeki birbirinin komplementeri olmayan bazların eşleşmesi halinde, hatalı eşleşen bazları tanımakta ve doğru bazı yerleştirmektedir. MLH1, MSH2, MSH6, MSH3, MLH3, PMS2, MGMT genleri hatalı- eşleşme tamir mekanizmasında görev almaktadır. Çalışmamızda parafine gömülü kolorektal kanser tanılı doku örnekleri kullanıldı. Toplam 70 adet örnek ile çalışıldı. Örneklerimiz 41 adet erkek (% 58,6) ve 29 adet kadın (% 41,4) olgulardan oluşmaktadır. Erkek örneklerin yaş ortalaması % 55,02, kadın örneklerin yaş ortalaması % 61,76 olarak tesbit edilmiştir. Örneklerin 49 adeti (% 70,0) adenokarsinom tanılı, 21 adeti (% 30,0) karsinom tanılı olgulardan oluşmaktadır. Multipleks ligasyon esaslı prob amplifkasyonu (MLPA) tek reaksiyonda aynı veya farklı genlere ait birden fazla hedef bölgelerinin amplifikasyonunu yapabilmektedir. Bu gen bölgelerinin metil-duyarlı kesim enzimi reaksiyonuna bağlı olarak metilasyon durumu ile ilgili bilgi verebilmektedir. Bu kesim reaksiyonu için HhaI restriksiyon endonükleaz enzimi kullanılmaktadır. Çalışmamızda MS-MLPA (Metilayon Spesifik Multipleks Ligasyon Esaslı Prob Ampklifikasyonu) yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntem ile tek reaksiyonda çok sayıda hedef bölge amplifiye edilebilmektedir. Ayrıca CpG dizisi içeren hedef bölgelerin metilasyon durumuna göre HhaI kesim enzimi aracılığıyla kesim işlemi gerçekleştirilmekte, bu işlem sonucunda hedef bölgenin amplifiye olup olmamasına bağlı olarak ilgili gen bölgesinin metilasyon durumunu saptanabilmektedir. Yaptığımız çalışmada kolon kanser tanılı olgulardaki hatalı eşleşme tamirinde görev yapan genlerin CpG bölgelerinde metilasyon sıklığı tesbit edildi. Elde edilen sonuçlar DNA tamirinde görev alan genlerde meydana gelen metilasyonun kolorektal karsinogenesize sebep olan faktörlerin arasında yer ald ığı konusunda önemli bir fikir verdi. Metilasyon duyarlı enzim kesim bölgesi içeren MLH1, MSH2, MSH6, MSH3, MLH3, PMS2, MGMT genlerine ait toplam 21 adet özgül hedef bölgenin prob amplifikasyonu yapıld ı. Bu amplifikasyon sonuçlarına göre metilasyon oranları ortalama MLH1 (% 97.14), MSH2 (% 24.28), MSH6 (% 67.14), MSH3 (% 78.57), MLH3 (%75.71), PMS2 (% 65.71), MGMT (% 82.85) olarak saptandı. Hatalı-eşleşme tamirinde sorumlu olan genlerde gözlenen bu metilasyon oranları kolorektal karsinogenesiz açısından oldukça anlamlı bulduk. Özellikle en yüksek metilasyon oranı bütün kolorektal kanser tiplerinde fonksiyon kayb ına en sık rastlanan MLH1 geninde gözlendi ki, bu durum çalışmamızla literatür arasında paralellik göstermektedir.